User:Pippu d'Angelo/Magnetotactic bacteria

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Magnetotactic bacteria are a class of bacteria discovered in the 1970s that are characterised by being able to orient themselves in response to the Earth's magnetic field (magnetotaxis).

Introduction

The first paper on this class of bacteria appeared in a 1975 issue of Science, written by the microbioligist, Richard Blakemore. While observing swamp sediments under his microscope, he noticed a group of bacteria which clearly oriented themselves in a certain direction. He soon realised that these microrganisms were following the direction of the Earth's magnetic field, from south to north, and thus the adjectival descriptor "magnetotactic" [1].

These bacteria have been the subject of many experiments, they have even been aboard the Space Shuttle to examine their magnetotactic properties in the absence of gravity, but a definitive conclusion was not reached [12]. There have also been claims of their existence on Mars because of the discovery of magnetic particles on a meteorite said to be of Martian origin, but even on this occasion the results were ambiguous [1].

Biology

Magnetotactic bacteria (MagnetoTactic Bacteria, MTB) are usually found in oxic-anoxic transition zones (OATZ - the transition zone between water and sediment) and they come in a variety of forms (e.g. coccus, vibrio and spirillum). Various MTB differ by number, layout and pattern of the bacterial magnetic particles (BMP) [3]. The MTB can be subdivided into two categories, according to whether they produce particles of magnetite ($\mathrm {Fe} _{3}\mathrm {O} _{4}$), or of greigite ($\mathrm {Fe} _{3}\mathrm {S} _{4}$); some species produce both. Magnetite possesses three times the magnetic properties of greigite [1].

The majority of magnetite mineralising MTB need a microaerobic environment to generate magnetosomes. Although beyond a certain threshold they stop producing more BMP and therefore begin to lose their magnetotaxis capability. However some types produce magnetite, even in anaerobic conditions, using nitric oxide or nitrate as a receptor for electrons. However these are part of the order of Alpha Proteobacteria. The greigite mineralising MTB are usually stritctly anaerobic and are related to sulphur reducing bacteria, therefore they are classified within the order of Delta Proteobacteria. This indicates a separate evolutionary path, representing a process of biomineralisation fundamentally different [2].

Quite possibly the evolutionary advantage of possessing a system of manetosomes is linked to the ability to efficiently maintain an optimal orienting in terms of chemical substances and redox reactions, reducing a potential three dimensional search to a single dimension (see further below for a description of this mechanism) [2]. Recently, the view has been put forward that the mechanism of aerotaxis is also closely associated with magnetotaxis [4].

BMP interact with each other through the formation of chains. In this microscopic image it is clearly visible in a Magnetospirillum magneticum. The magnetic dipole of the cell is therefore the sum of the dipoles of the single BMP which are sufficient to passively orientate the cell to overcome the casual thermal forces of a wet environment [2]. In the presence of more than one chain, the inter-chain repulsive forces push them to the edge of the cell, inducing turgor [1].

Magnetism

Physically, the development of a magnetic crystal is governed by two factors: one moving to align the magnetic force of the molecoles in conjunction with the developing crystal, while the other reduces the magnetic force of the cyrstal, allowing an attachment of the molecole while experiencing an opposite magnetic force. In nature this causes the existence of a magnetic domain, surrounding the perimeter of the domain, with a thickness of approxmiately 150 nm of magnetite, within which the molecules gradually change orientation. For this reason macroscopically the iron is not magnetic in the absence of an applied field. Similarly, extremely small magnetic particles do not exhibit signs of magnetisation at room temperature, their magnetic force is continually altered by the thermal motions inherent in their composition [1]. Instead MTB are of a size between 35 e 120 nm, that is, big enough to have a permanent magnetic field and at the same time small enouch to remain a single magnetic domain. [2].

The inclination of the Earth's magnetic field in the two respective hemispheres selects one of the two possible polarities of the magnetotactic cells (with respect to the flaggelated pole of the cell), orienting the biomineralisation of the BMP. In fact more than 99.9% of the population of MTB in the northern hemisphere orients and swims in a northerly direction, effectively heading towards shallower reaches (due to the pattern of the magnetic field) which possess less toxic concentrations of oxygen. This works in reverse, with the identical result, in the southern hemisphere. On the equator, where the lines of the geomagnetic fields are horizontal, there exist roughly the same number of cells possessing both polarities. [2].

Magnetosomes

The biomineralisation of the magnetite is brought about by the regulating mechanisms of the concentration of iron, by the nucleation of crystal, of the potential redox and of the pH. The compartimentalisation in magnetosomes permits the biochemical control of such processes. After the sequencing of the genome of certain species of MTB, a comparative analysis of the proteins involved in the formation of BMP became possible. In this way similarities in the sequence between members of the ubiquitaria family CDF (Cation Diffusion Facilitator) and the serine compound Htr-simili. The first are invovled exclusively in the transport of heavy metals, the second are types of Hsps which degrade those proteins poorly absorbed. These proteins of the magnetosomial membrane (MM) beyond the serine proteases domain contain PDZ domains. Other MM proteins contain TPR domains (Tetratric Peptide Repeat) [3].

TPR domain

The TPR domains fold into two alpha helices and produce a sequence of 8 amino acids (of the 34 possible) which are the most commonly found in nature. Apart from these, the remainder of the structure specialises in those functions best adapted to the environment. The more notable compounds that comprise TPR protens include:

1. membrane compounds that bind the proteins and transport them to within the mitochondria and/or perossisomi
2. compounds that recognise the binding proteins as the DNA represses the transcription
3. the anaphase promoting complex (APC}.

There exist examples of both the TPR-TPR interactions as well as the TPR-nonTPR [6]. The diagrams below show the 8 residual ones conserved as sphere-rods from two different angles: W-LG-Y-A-F(here Y)-A-P.

PDZ domain

The PDZ domains are modular structures which are made of 6 beta filaments and 2 alpha helices which recognise the C amino acids of the proteins in a specific sequence. Often the third from last is fosforilabile, such that it prevents the interaction with the PDZ domain. The only residues conserved are those subordinate to the recognition of the COOH terminal (RKXXXGLGF). They are widespread in nature to the extent that they constitute the structure upon which the multi proteases compounds are built, in particular, those associated with proteins of membranes such as the ducts K⁺inward rectifier or the beta receptors ₂-adrenergic [15].

Membrane and proteins

The formation of the MM passes through at least three stages. In the first an invagination of the citoplasmatic membrane is formed from guanosine triphosphate. This process can also be observed amongst the eukaryote.

The second stage requires the entrance of ferric ions into the newly formed vesicle from the external environment. Even in a culture deficient in Fe³⁺ the MTB succeed at accumulating increased intracellular concentrations of a secretion at an extremely low molecular mass highly specialised in inducing Fe³⁺ as required. The compound Ferro-sideroforo is thereby moved in the cytoplasm, where it subdivides. The ferric ions must be converted into ferrous particles so that they can be accumulated by the BMP with the help of a trans-membrane transporter with a corresponding opposite force Na⁺/H⁺. In reality, it is a functioning H⁺/Fe²⁺ at a protonic gradient. This is localaised as much in the cytoplasmic membrane as the MM, but in an inverted orientation, such that in the first type it is like an effluent of iron, and in the second an influx. Being decidedly more ubiquitous in the MM, the effluent of iron from the cytoplasmic membrane is superfluous. In any case this step is strictly controlled by a system of redox of cytochromes not yet fully integrate and, it would seem, species specific.

In the final stage the nucleationn of the crystal is triggered by the magnetite by the trans-membrane proteins with acidic and basic domains. One of these proteins, called Mms6, has been used in the artificial synthesis of magnetite, and its presence permits the productoin of cystals homogeneous in shape and size.

Many other proteins associated with MM probably carry out roles in generating concentrations of supersaturations of iron, in maintaining less favourable conditions in the oxidisation of iron or in the partial reduction and dehydration of the ferridrate [4].

Biomineralisation

In cultivating Magnetospirillum magnetotacticum the iron cannot be substituted with other transitory metals (Ti, Cr, Co, Cu, Ni, Hg, Pb) that may be found in the earch, even if they have been treated. Much in the same way that oxygen and sulphur are not interchangeable as non metallic substances of the magnetosome within the same species. This is an indicator of the existence of of varoius geni in the biomineralisation of magnetite and grigite [2].

In terms of thermodynamics, the inorganic synthesis of magnetite is preferred when compared to other iron oxides of a neutral pH and a low potential redox. It would thus appear that the microaerobic conditions, or the anaerobic, create a potential adaptation in the formation of the BMP. Moreover the influx of iron is rapidly converted iton magnetite, indicating that the formation of cystals is not predicated on an accumulation of iron under other forms and that the structure and the enzymes created in the biomineralization process are already present within the cell. This conclusion is also supported by the fact that MTB which is cultivated in aerobic conditions (and thus non magnetic) contains a comparable quantum of iron and a few other species of bacteria [9].

Applications

The unique characteristics of BMP permit practical uses in a variety of fields, improving upon older techniques and introducing completely new ones. Common advantages amongst these areas include:

1. being surrounded by a double layer helps form compounds that are easily dispersed in watery solutions, as opposed to articles that are obtained artificially [4]
2. their size renders them superparamagnetic, that is, they quickly follow changes in the external magnetic field without any remnants of the preceding polarity [10].

Biotechnology

Negli ultimi anni l'uso di tecniche magnetiche è esploso e si è diversificato molto nel campo biotecnologico. I vantaggi principali sono l'alta scalabilità, rapidità e l'uso di reagenti non tossici ne pericolosi. La maggior parte delle particelle magnetiche artificiali (AMP) usate ricade in una di tre categorie:

1. particelle nude, ricoperte con polimeri (cellulosa, poliacroleina, silano, vetro borosilicato poroso, polistirene, resine a scambio ionico) derivati chimicamente per introdurre gruppi superficiali come COOH, NH₂, alchilammine a lunga catena, prodotti dell'idrazide
2. particelle coniugate a ligandi con specificità generale, come streptavidina, oligo-dT, ProteinaA, ProteinaG
3. particelle coniugate a ligandi ad alta specificità, come Ig ed enzimi

Le dimensioni ricadono per lo più nel range 1-5 µm di diametro, rendendo necessario un continuo mescolamento per avere un'efficiente binding. Di contro le forze di taglio possono danneggiare i ligandi, sia cellule che biomolecole, se si eccede nell'agitazione. Nel caso si abbia a che fare con popolazioni cellulari può essere necessario staccare le AMP dalle cellule, che risentirebbero della loro ingombrante presenza [13]. Per questi motivi le BMP potrebbero trovare il loro spazio nella ricerca biotecnologica in sostituzione delle AMP, almeno in certe applicazioni.

Un'interessante integrazione delle particelle magnetiche con le tecniche di DNA ricombinante prevede l'uso di vettori esprimenti un marker di superficie come il CD4 o le MHC-I di topo. In tal modo è possibile, usando particelle magnetiche coniugate con un anticorpo contro tali marker, isolare in gran rapidità le cellule trasfettate con successo [13]. Questa tecnica potrebbe essere estesa a cellule procariote, e l'uso di BMP ricombinanti esprimenti l'Ig di selezione potrebbe rendere indipendente un laboratorio di ricerca dall'acquisto di sempre nuove AMP coniugate con l'anticorpo.

Le BMP si prestano molto bene come carrier di proteine ricombinanti o di proteine àncora, con applicazioni nella ricerca, nella diagnostica e come biosensori. In un esperimento classico, usando una proteina di fusione MagA-Luc (Luc=Luciferasi, MagA=proteina dei MTB), si è dimostrato che MagA è localizzata sulla superficie delle BMP. Quindi con un vettore di espressione plasmidico si è fatta esprimere in un MTB la proteina ricombinante MagA-ProteinaA, che grazie alla parte derivata da MagA si localizza sulle BMP e per mezzo della ProteinaA può legare la parte costante delle Ig. Isolate le BMP ricombinanti le si è incubate con l'anticorpo anti-IgG coniugato con la Fosfatasi Alcalina. In questo modo si è potuto dimostrare, usando un substrato luminescente per la Fosfatasi Alcalina, che l'anticorpo era effettivamente legato alle BMP perché la ProteinaA era fusa con MagA. Contrariamente, BMP prodotte da MTB esprimenti MagA e ProteinaA separate emettevano una luminescenza trascurabile, segno che la ProteinaA da sola non ha affinità per le BMP [7].

Per aumentare il segnale luminoso di questo saggio occorre aumentare la quantità di ProteinaA espressa sulle BMP e quindi usare un vettore di espressione più forte, che sia cioè ad alto numero di copie, stabile e derivato dall'ospite. In Magnetospirillum magneticum è stato scoperto un plasmide criptico denominato pMGT con queste caratteristiche. E' lungo circa 3,7 kb ed ha due potenziali ORF codificanti le proteine Rep e Mob. Tagliando pMGT in modo che contenga la regione replicativa si ottiene un frammento di 3 kb funzionale. Nonostante elettroporazione (usata per trasformare il plasmide) uccida i MTB contenenti BMP, è possibile effettuarla in condizioni aerobiche, nelle quali le BMP non sono prodotte. Successivamente il ripristino dell'anaerobiosi permette ai MTB di riprendere a biomineralizzare le BMP [8].

Con caratteristiche simili il plasmide può essere impiegato per ricombinare a proteine della MM vari target della ricerca farmacologica: un esempio su tutti, i recettori a sette domini transmembrana. Proprio uno di essi è stato clonato ed espresso sulle BMP per dimostrare che la proteina ricombinante manteneva la caratteristica di legare i propri agonisti ed antagonisti (marcati con una molecola fluorescente). Questo sistema inoltre è in grado di quantificare l'interazione e può essere scalato per una larga produzione di BMP ricombinanti per Ig, enzimi, ... mantenendone l'attività [4].

Replicazione plasmidica

La minima regione replicativa deve contenere una sequenza di origine ori (ricca di AT, dove avviene la separazione delle eliche), delle sequenze ripetute per il legame di Rep (iteroni), i boxes per la DnaA (codificata dall'ospite) ed il gene rep. Il legame di Rep e DnaA favoriscono la distorsione dell'elica a livello di ori che, per l'alta percentuale di AT, si separa in due emieliche. Da qui parte la replicazione col legame delle proteine SSB e della DnaB (elicasi) [14].

Medicine

Le caratteristiche delle BMP possono tornare molto utili in campo medico, in diagnosi come in terapia. Le AMP essendo prodotte per sintesi chimica o per via meccanica risentono delle loro disomogenee qualità fisico-chimiche. Inoltre le proprietà delle particelle dovrebbero essere riproducibili. Le possibili applicazioni mediche richiedono particelle superparamagnetiche come le BMP. Ovviamente occorre stabilità alle condizioni fisiologiche di pH, salinità ed osmolarità. Devono essere facilmente disperdibili e non tossiche. Quindi a seconda se queste particelle verranno usate in vivo od in vitro ci saranno altre restrizioni. Per applicazioni in vivo è necessario evitare la formazione di agglomerati, con rischio di embolia vasale. Qui tornano utili le dimensioni nanoscopiche delle BMP, che conferiscono bassissime velocità di sedimentazione (quindi stabilità colloidale), migliore diffusione tissutale ed enorme area superficiale. Quest'ultima proprietà è importante se si intende fissare sulla superficie delle BMP un ligando. La magnetite è tuttora il materiale magnetico più usato in medicina per la sua bassa tossicità ed immunogenicità. Per applicazioni in vitro le restrizioni sono minori [10].

Le applicazioni in vivo possono essere ulteriormente suddivise in terapeutiche e diagnostiche, mentre quelle in vitro sono principalmente diagnostiche per il momento. Fra le prime, le due tecniche più discusse sono l'ipertermia e la veicolazione di farmaci. Con la prima si intende una procedura terapeutica usata per innalzare la temperatura di una regione del corpo colpita da un tumore. È praticata in concomitanza con altre terapie anticancro e si basa sul fatto che sopra i 41-42°C le cellule muoiono per shock termico. Le particelle magnetiche, dopo una somministrazione endovenosa, possono essere tenute in loco da un campo magnetico esterno, costante prima, ed alternato poi, causando un "effetto Joule" magnetico dovuto alla continua riorientazione della magnetizzazione delle particelle (che hanno bassa conducibilità elettrica). Le nanoparticelle assorbono molta più potenza in campi magnetici AC tollerabili e la loro uniformità dimensionale è fondamentale per un controllo preciso della temperatura [10].

Le stesse particelle possono essere usate per trasportare farmaci, radionuclei od anticorpi, per un rilascio controllato nel tempo e nello spazio, aumentando le concentrazioni in situ e diminuendo gli effetti collaterali. Nel caso di un tumore per esempio è possibile far extravasare le particelle magnetiche grazie ad un forte campo magnetico. Queste rimangono intrappolate nel tessuto maligno dove rilasciano il principio attivo o le radiazioni. Con le BMP è possibile preparare magnetoliposomi contenenti agenti antitumorali [11].

La risonanza magnetica nucleare ad immagine (iNMR) utilizza una classe particolare di farmaci, i cosiddetti magnetofarmaceutici, da somministrare al paziente per invigorire il contrasto tra tessuti sani e malati, per visualizzare la circolazione sanguigna e lo stato degli organi. Si possono così distinguere infarti cerebrali e cardiaci, lesioni epatiche, tumori, infiammazioni ed ischemie. Ancora una volta le piccole dimensioni fan risaltare differenze utili tra i tessuti come la composizione ed i processi endocitotici [10].

Nelle tecniche in vitro è possibile separare una popolazione cellulare che esprime un particolare epitopo in mezzo a molti altri tipi cellulari. Per lo scopo si sfrutta una selezione positiva se l'anticorpo è specifico per il tipo cellulare voluto, negativa (o di arricchimento) se gli anticorpi sono specifici per le cellule non-target [13].

Recentemente è stata introdotta una nuova tecnica di valutazione dei saggi immunologici chiamata magnetorilassometria. Essa misura la viscosità magnetica, cioè il rilassamento del momento magnetico netto, di un sistema dopo la rimozione del campo magnetico esterno. La viscosità magnetica dipende dalle dimensioni idrodinamiche e del nocciolo, e dall'anisotropia delle particelle, e permette di distinguere tra quelle coniugate con un ligando e quelle libere grazie al diverso comportamento magnetico [10].

Bibliography

• [1] Cat Faber, Living Lodestones: Magnetotactic bacteria, 2001
• [2] Bazylinski, Controlled biomineralization of magnetic minerals by magnetotactic bacteria, 1995 Chemical Geology Elsevier
• [3] Schuler, The biomineralization of magnetosomes in Magnetospirillum gryphiswaldense, 2002 Int Microbiol
• [4] Matsunaga, Okamura, Genes and proteins involved in bacterial magnetic particle formation, 2003 Trends in Microbiology Elsevier
• [6] Lamb, Tugendreich, Hieter, Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR?, 1995 TIBS Elsevier
• [7] Matsunaga, Sato, Kamiya, Tanaka, Takeyama, Chemiluminescence enzyme immunoassay using ProteinA-Bacterial magnetite complex, 1999 Journal of magnetism and magnetic materials Elsevier
• [8] Okamura, Takeyama, Sekine, Sakaguchi, Wahyudi, Sato, Kamiya, Matsunaga, Design and application of a new cryptic-plasmid-based shuttle vector for Magnetospirillum magneticum, 2003 Appl Env Microbiol
• [9] Schuler, Baeuerlein, Dynamics of iron uptake and Fe3O4 biomineralization during aerobic and microaerobic growth of Magnetospirillum gryphiswaldense, 1998 J. Bacteriol
• [10] Tartaj, Morales, Veintemillas-Verdaguer, Gonzales-Carreno, Serna, The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine, 2003 J. Phys. D: Appl. Phys.
• [11] Saiyed, Telang, Ramchand, Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine, 2003 Biomag Res Tech Biomed Central
• [12] Urban, Adverse effects of microgravity on the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum, 2000 Acta Astronautica Elsevier
• [13] Sinclair, To bead or not to bead: applications of magnetic bead technology, 1998 The scientist http:www.thescientist.com
• [14] Finbarr Hayes, DNA replication and repair,
• [15] Sheng, Sala, PDZ domains and the organization of supramolecular complexes, 2001 Ann. Rev. Neurosc.